Le degré de pureté protéique requis dépend de l'utilisation finale prévue de la protéine.
Pour certaines applications, un extrait brut est suffisant. Cependant, pour d'autres utilisations, comme dans les aliments et les produits pharmaceutiques, un niveau élevé de pureté est requis. Pour y parvenir, plusieurs méthodes de purification de protéines sont typiquement utilisées, dans une série d'étapes de purification.
Chaque étape de purification des protéines entraîne généralement un certain degré de perte de produit. Par conséquent, une stratégie de purification de protéines idéale est celle dans laquelle le plus haut niveau de purification est atteint dans le moins d'étapes. La sélection des étapes à utiliser dépend de la taille, de la charge, de la solubilité et d'autres propriétés de la protéine cible. Les techniques suivantes sont les plus appropriées pour la purification d'une seule protéine cytosolique. La purification des complexes protéiques cytosoliques est plus compliquée et nécessite généralement l'application de différentes méthodes.
Premières étapes de la purification des protéines
La première étape dans la purification des protéines intracellulaires (à l'intérieur de la cellule) est la préparation d'un extrait brut .
L'extrait contiendra un mélange complexe de toutes les protéines du cytoplasme cellulaire et de quelques macromolécules, cofacteurs et nutriments supplémentaires. L'extrait brut peut être utilisé pour certaines applications en biotechnologie, cependant, si la pureté est un problème, les étapes de purification suivantes doivent être suivies.
Des extraits protéiques bruts sont préparés par élimination de débris cellulaires générés par la lyse cellulaire, ce qui est réalisé en utilisant des produits chimiques et des enzymes , la sonication ou une presse française. Les débris sont éliminés par centrifugation et le surnageant est récupéré. Des préparations brutes de protéines extracellulaires peuvent être obtenues en enlevant simplement les cellules par centrifugation.
Pour certaines applications biotechnologiques , il existe une demande pour des enzymes thermostables : Des enzymes capables de tolérer des températures élevées sans se dénaturer, tout en maintenant une activité spécifique élevée. Les organismes qui les produisent sont parfois appelés extrémophiles. Une approche facile pour purifier une protéine thermorésistante consiste à dénaturer les autres protéines du mélange en chauffant, puis en refroidissant la solution (permettant ainsi à l'enzyme thermostable de se reformer ou de se redissoudre, si nécessaire.) Les protéines dénaturées peuvent ensuite être éliminées par centrifugation.
Étapes intermédiaires de purification
Dans le passé, une deuxième étape commune à la purification d'une protéine à partir d'un extrait brut était par précipitation dans une solution avec une force osmotique élevée (c'est-à-dire des solutions salines). Les acides nucléiques dans l'extrait brut peuvent être éliminés en précipitant des agrégats formés avec du sulfate de streptomycine ou du sulfate de protamine.
La précipitation des protéines est généralement effectuée en utilisant du sulfate d'ammonium comme sel.
Différentes protéines vont précipiter à différentes concentrations de sulfate d'ammonium . En général, les protéines de plus haut poids moléculaire précipitent à des concentrations plus faibles de sulfate d'ammonium. La précipitation du sel ne conduit généralement pas à une protéine hautement purifiée mais peut aider à éliminer certaines protéines indésirables dans un mélange et à concentrer l'échantillon. Les sels dans la solution sont ensuite éliminés par dialyse à travers un tube de cellulose poreux, une filtration ou une Chromatographie d'exclusion sur gel.
Les protocoles biotechnologiques modernes tirent souvent parti des nombreux kits disponibles dans le commerce qui fournissent des solutions prêtes à l'emploi pour les procédures standard. La purification des protéines est souvent effectuée en utilisant des filtres et des colonnes de filtration sur gel préparées. Tout ce que vous avez à faire est de suivre les instructions et d'ajouter le bon volume de la bonne solution et attendre la durée spécifiée tout en recueillant l'éluant (ce qui sort de l'autre extrémité de la colonne) dans un tube à essai frais.
- Les méthodes chromatographiques peuvent être appliquées à l'aide de colonnes de laboratoire ou d'un équipement HPLC automatisé. La séparation par HPLC peut être effectuée par des procédés en phase inverse, par échange d'ions ou par exclusion de taille, et des échantillons peuvent être détectés par un réseau de diodes ou une technologie laser. Les
Visualisation des protéines et évaluation de la purification
- La chromatographie en phase inverse (RPC) sépare les protéines en fonction de leur hydrophobie relative. Cette technique est très sélective mais nécessite l'utilisation de solvants organiques. Certaines protéines sont dénaturées de manière permanente par les solvants et perdront leur fonctionnalité au cours de RPC. Par conséquent, cette méthode n'est pas recommandée pour toutes les applications, en particulier s'il est nécessaire que la protéine cible conserve son activité.
- La chromatographie par échange d'ions fait référence à la séparation des protéines en fonction de la charge . Les colonnes peuvent être préparées pour l'échange d'anions ou l'échange de cations. Les colonnes d' échange d'anions contiennent une phase stationnaire avec une charge positive qui attire les protéines chargées négativement. Les colonnes d' échange de cations sont des perles inverses chargées négativement qui attirent des protéines chargées positivement. L'élution de la (des) protéine (s) cible (s) est effectuée en changeant le pH dans la colonne, ce qui entraîne un changement ou une neutralisation des groupes fonctionnels chargés de chaque protéine.
- La chromatographie d'exclusion de taille ( filtration sur gel ) sépare les plus grosses protéines des plus petites puisque les plus grosses molécules se déplacent plus rapidement à travers le polymère réticulé dans la colonne de chromatographie. Les grosses protéines ne rentrent pas dans les pores du polymère alors que les protéines plus petites le font, et prennent plus de temps pour se déplacer à travers la colonne de chromatographie, via leur voie moins directe. L'éluat est recueilli dans une série de tubes séparant les protéines en fonction du temps d'élution. La filtration sur gel est un outil utile pour concentrer un échantillon de protéine puisque la protéine cible est recueillie dans un volume d'élution plus petit que celui initialement ajouté à la colonne. Des techniques de filtration similaires pourraient être utilisées lors de la production de protéines à grande échelle en raison de leur rentabilité.
- La chromatographie d'affinité est une technique très utile pour «polir» ou compléter le processus de purification des protéines. Les perles dans la colonne de chromatographie sont réticulées à des ligands qui se lient spécifiquement à la protéine cible. La protéine est ensuite éliminée de la colonne par rinçage avec une solution contenant des ligands libres. Cette méthode donne les résultats les plus purs et l'activité spécifique la plus élevée par rapport à d'autres techniques.
- SDS-PAGE est une électrophorèse sur gel de polyacrylamide, réalisée en présence de SDS (dodécylsulfate de sodium) qui se lie à des protéines en leur donnant une grande charge négative nette. Puisque les charges de toutes les protéines sont assez égales, cette méthode les sépare presque entièrement en fonction de la taille. SDS-PAGE est souvent utilisé pour tester la pureté de la protéine après chaque étape d'une série. Comme les protéines indésirables sont progressivement éliminées du mélange, le nombre de bandes visualisées sur le gel SDS-PAGE est réduit, jusqu'à ce qu'il n'y ait qu'une bande représentant la protéine désirée.
- L'immunotransfert est une technique de visualisation des protéines appliquée en combinaison avec la chromatographie d'affinité. Les anticorps pour une protéine spécifique sont utilisés comme ligands sur une colonne de chromatographie d'affinité. La protéine cible est retenue sur la colonne, puis éliminée par rinçage de la colonne avec une solution de sel ou d'autres agents. Les anticorps liés aux marqueurs radioactifs ou colorants favorisent la détection de la protéine cible une fois séparée du reste du mélange.
Sources:
Zubay G. 1988. Biochimie, 2e édition. Macmillan Publishing Co., New York, NY, États-Unis.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Manuel de purification des protéines, édition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., New Jersey, États-Unis. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.