Que PCR doit faire avec le séquençage de l'ADN et les gènes amplificateurs
La réaction en chaîne de la polymérase ( PCR ) est une technique génétique moléculaire permettant de réaliser de multiples copies d'un gène et fait également partie du processus de séquençage génétique.
Comment fonctionne la réaction en chaîne de la polymérase?
Les copies de gènes sont faites en utilisant un échantillon d'ADN, et la technologie est assez bonne pour faire plusieurs copies à partir d'une seule copie du gène trouvé dans l'échantillon. L'amplification par PCR d'un gène permettant de faire des millions de copies, permet la détection et l'identification de séquences de gènes en utilisant des techniques visuelles basées sur la taille et la charge (+ ou -) de la pièce d'ADN.
Dans des conditions contrôlées, de petits segments d'ADN sont générés par des enzymes connues sous le nom d'ADN polymérases, qui ajoutent des désoxynucléotides complémentaires (dNTP) à un fragment d'ADN connu sous le nom de «matrice». Même de plus petits morceaux d'ADN, appelés "amorces" sont utilisés comme point de départ pour la polymérase. Les amorces sont de petits morceaux d'ADN synthétiques (oligomères), habituellement longs de 15 à 30 nucléotides. Ils sont faits en connaissant ou en devinant de courtes séquences d'ADN aux extrémités du gène amplifié. Pendant la PCR, l'ADN en cours de séquençage est chauffé et les doubles brins séparés. Lors du refroidissement, les amorces se lient au gabarit (appelé recuit) et créent une place pour le démarrage de la polymérase.
La technique de PCR
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été rendue possible par la découverte de thermophiles et d'enzymes polymérases thermophiles (enzymes qui maintiennent l'intégrité structurelle et la fonctionnalité après un chauffage à haute température).
Les étapes impliquées dans la technique PCR sont les suivantes:
- Un mélange est créé, avec des concentrations optimisées de la matrice d'ADN, de l'enzyme polymérase, des amorces et des dNTP. La capacité de chauffer le mélange sans dénaturer l'enzyme permet de dénaturer la double hélice de l'échantillon d'ADN à des températures de l'ordre de 94 degrés Celsius.
- Après la dénaturation, l'échantillon est refroidi à une plage plus modérée, autour de 54 degrés, ce qui facilite l'hybridation (liaison) des amorces aux matrices d'ADN monocaténaire.
- Dans la troisième étape du cycle, l'échantillon est réchauffé à 72 degrés, la température idéale pour l'ADN polymérase Taq, pour l'allongement. Pendant l'allongement, l'ADN polymérase utilise le brin unique d'ADN d'origine comme matrice pour ajouter des dNTP complémentaires aux extrémités 3 'de chaque amorce et générer une section d'ADN double brin dans la région du gène d'intérêt.
- Les amorces qui ont recuit à des séquences d'ADN qui ne correspondent pas exactement ne restent pas recuites à 72 degrés, limitant ainsi l'allongement au gène d'intérêt.
Ce processus de dénaturation, d'annelage et d'allongement est répété plusieurs fois (30-40) fois, ce qui augmente exponentiellement le nombre de copies du gène désiré dans le mélange. Bien que ce processus soit assez fastidieux s'il est effectué manuellement, les échantillons peuvent être préparés et incubés dans un thermocycleur programmable, maintenant courant dans la plupart des laboratoires moléculaires, et une réaction de PCR complète peut être effectuée en 3-4 heures.
Chaque étape de dénaturation arrête le processus d'élongation du cycle précédent, tronquant ainsi le nouveau brin d'ADN et le gardant approximativement à la taille du gène désiré.
La durée du cycle d'élongation peut être plus longue ou plus courte selon la taille du gène d'intérêt, mais finalement, à travers des cycles répétés de PCR, la majorité des modèles sera limitée à la taille du gène d'intérêt seul, car ils aura été généré à partir des produits des deux amorces.
Il existe plusieurs facteurs différents pour une PCR réussie qui peuvent être manipulés pour améliorer les résultats. La méthode la plus largement utilisée pour tester la présence de produit de PCR est l' électrophorèse sur gel d'agarose . Ce qui est utilisé pour séparer les fragments d'ADN en fonction de la taille et de la charge. Les fragments sont ensuite visualisés en utilisant des colorants ou des radio-isotopes.
L'évolution
Depuis la découverte de la PCR, des ADN polymérases autres que la Taq originale ont été découvertes. Certains d'entre eux ont une meilleure capacité de "relecture" ou sont plus stables à des températures plus élevées, améliorant ainsi la spécificité de la PCR et réduisant les erreurs dues à l'insertion du dNTP incorrect.
Certaines variantes de la PCR ont été conçues pour des applications spécifiques et sont maintenant utilisées régulièrement dans les laboratoires de génétique moléculaire. Certains d'entre eux sont la PCR en temps réel et la PCR en reverse-transcriptase. La découverte de la PCR a également conduit au développement du séquençage de l'ADN, des empreintes génétiques et d'autres techniques moléculaires.