Des ajustements à l'un des composants d'une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) peuvent altérer la qualité du résultat, soit en améliorant ou en diminuant le rendement et la qualité du produit, soit en améliorant la spécificité et la sensibilité de la réaction. Les paramètres qui influent sur le résultat final peuvent être soit physiques (c.-à-d., Température, temps de cycle) ou chimiques (c.-à-d. Concentration de gabarit, type d'enzyme utilisé). Ce qui suit sont plusieurs facteurs clés qui influencent le succès de la PCR.
01 Conditions de laboratoire propres
Puisque la PCR est capable de détecter une seule molécule d'ADN, il est important de maintenir des conditions parfaites en laboratoire. Toujours porter des gants propres, utiliser de la verrerie stérile, des tubes et des embouts de pipette et des solutions stériles, et nettoyer la zone de travail avant de commencer le travail.
Toujours inclure les réactions de contrôle, sans matrice d'ADN et sans enzyme, pour s'assurer que les résultats sont vraiment dus à l'amplification du bon échantillon.
La plupart des gens s'assurent d'avoir leur propre ensemble de solutions qui ne sont pas partagées pour faciliter le dépannage et les pipettes désignées sont souvent réservées à la PCR. Les tubes PCR sans DNase et RNase, les embouts de pipettes résistants aux aérosols et fonctionnant dans une hotte avec des rayons UV sont également des moyens de minimiser les problèmes.
02 Composants chimiques
- Avoir 18 à 24 bases
- N'avoir aucune structure secondaire (c.-à-d. Boucles en épingle à cheveux)
- Avoir une distribution équilibrée des paires G / C et A / T
- Ne sont pas complémentaires l'un à l'autre à l'extrémité de 3 pieds
- Ont des températures de fusion (Tm) d'environ 5-10 degrés Celsius en dessous de la température de recuit, qui est généralement comprise entre 55 et 65 degrés Celsius
Le Tm pour les deux amorces devrait également être similaire pour de meilleurs résultats.
03 Mélange réactionnel: modèle et amorces
Les concentrations d'amorces optimales sont comprises entre 0,1 et 0,6 micromole / L. La quantité de matrice varie en fonction du type d'ADN (humain, bactérien, plasmide).
Avec de très faibles quantités de modèles, il existe d'autres stratégies pour améliorer les résultats, comme l'augmentation du nombre de cycles ou l'utilisation du «démarrage à chaud». Toujours tester de nouvelles amorces avec une réaction de contrôle positif, pour être sûr qu'ils fonctionnent dans vos conditions expérimentales spécifiques.
04 Mélange réactionnel: Activité enzymatique
La concentration de MgCl2 dans le mélange réactionnel peut influencer le résultat de la PCR et pourrait jouer un rôle important dans des réactions plus fastidieuses. Le cation de magnésium forme des complexes solubles avec les dNTP pour produire le substrat réel que l'enzyme polymérase reconnaît.
Des quantités égales des quatre dNTP contribuent également à réduire le taux d'erreur de la polymérase. Certains additifs tels que la bétaïne, la BSA, les détergents, le DMSO, le glycérol et la pyrophosphatase peuvent également affecter la spécificité enzymatique ou l'efficacité de la réaction.
05 Type de thermocycleur
Lors de l'achat d'équipement de laboratoire, gardez à l'esprit que certains thermocycleurs sont moins précis que d'autres à maintenir des températures exactes et désirées.
C'est un domaine où aller bon marché ne sera pas rentable à long terme lorsque vous êtes confronté à une réaction difficile ou en utilisant des amorces qui nécessitent une plage étroite de température de recuit.
Des tubes de réaction à parois minces conçus pour s'adapter à la marque précise de thermocycleur que vous utilisez aident également à optimiser les températures de réaction.
06 Paramètres du cycle
Un rendement accru peut être obtenu en augmentant le temps d'extension environ tous les 20 cycles, pour compenser moins d'enzyme pour amplifier plus de modèle. Habituellement, moins de 40 cycles suffisent à amplifier moins de 10 molécules de matrice à une concentration suffisamment grande pour être visualisée sur un gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium.