Le clonage de gènes est l'acte de faire des copies, ou des clones, d'un seul gène. Une fois qu'un gène est identifié, les clones peuvent être utilisés dans de nombreux domaines de la recherche biomédicale et industrielle. Le génie génétique est le processus de clonage de gènes dans de nouveaux organismes ou de modification de la séquence d'ADN pour changer le produit protéique. Le génie génétique dépend de notre capacité à effectuer les procédures essentielles suivantes.
01 Réaction en chaîne de la polymérase
02 Enzymes de restriction
La découverte d' enzymes connues sous le nom d'endonucléases de restriction a été essentielle à l'ingénierie des protéines . Ces enzymes coupent l'ADN à des emplacements spécifiques en fonction de la séquence nucléotidique. Des centaines d' enzymes de restriction différentes, capables de couper l'ADN sur un site distinct, ont été isolées à partir de nombreuses souches différentes de bactéries. L'ADN coupé avec une enzyme de restriction produit de nombreux fragments plus petits, de tailles variables. Ceux-ci peuvent être séparés en utilisant une électrophorèse sur gel ou une Chromatographie.
03 Electrophorèse
Purifier l'ADN d'une culture cellulaire, ou le couper en utilisant des enzymes de restriction ne serait pas très utile si nous ne pouvions pas visualiser l'ADN - c'est, trouver un moyen de voir si votre extrait contient quelque chose, ou quelle taille vous fragmente Je l'ai coupé. Une façon de le faire est par électrophorèse sur gel. Les gels sont utilisés à diverses fins, depuis la visualisation de l'ADN coupé jusqu'à la détection des inserts d'ADN et des knock-out.
04 Joignez deux morceaux d'ADN
Dans la recherche génétique, il est souvent nécessaire de lier deux ou plusieurs brins d'ADN individuels, de créer un brin recombinant ou de fermer un brin circulaire qui a été coupé avec des enzymes de restriction. Les enzymes appelées ADN ligases peuvent créer des liaisons covalentes entre les chaînes nucléotidiques. Les enzymes ADN polymérase I et polynucléotide kinase sont également importantes dans ce procédé, pour remplir des espaces ou phosphoryler les extrémités 5 ', respectivement.
05 Sélection de petits ADN auto-réplicants
De petits fragments circulaires d'ADN qui ne font pas partie d'un génome bactérien, mais qui sont capables d'auto-réplication, sont connus sous le nom de plasmides. Les plasmides sont souvent utilisés comme vecteurs pour transporter les gènes entre les micro-organismes. En biotechnologie, une fois que le gène d'intérêt a été amplifié et que le gène et le plasmide sont coupés par des enzymes de restriction, ils sont ligaturés ensemble, générant ce que l'on appelle un ADN recombinant. L'ADN viral (bactériophage) peut également être utilisé comme vecteur, de même que les cosmides, des plasmides recombinants contenant des gènes de bacteriophages.
06 Méthode de déplacement d'un vecteur dans une cellule hôte
Le processus de transfert de matériel génétique sur un vecteur tel qu'un plasmide, dans de nouvelles cellules hôtes, est appelé transformation. Cette technique nécessite que les cellules hôtes soient exposées à un changement environnemental qui les rend "compétentes" ou temporairement perméables au vecteur. L'électroporation est une de ces techniques. Plus le plasmide est grand, plus l'efficacité avec laquelle il est absorbé par les cellules est faible. Des segments d'ADN plus grands sont plus facilement clones en utilisant un bacteriophage, un rétrovirus ou d'autres vecteurs viraux ou des cosmides dans une méthode appelée transduction. Les vecteurs phagiques ou viraux sont souvent utilisés en médecine régénérative, mais peuvent entraîner l'insertion d'ADN dans des parties de nos chromosomes où nous n'en voulons pas, provoquant des complications et même le cancer.
07 Méthodes de sélection des organismes transgéniques
Toutes les cellules ne prendront pas l'ADN pendant la transformation. Il est essentiel qu'il y ait une méthode pour détecter ceux qui le font. En général, les plasmides portent des gènes pour la résistance aux antibiotiques et des cellules transgéniques peuvent être sélectionnées sur la base de l'expression de ces gènes et de leur capacité à se développer sur des milieux contenant cet antibiotique. D'autres méthodes de sélection dépendent de la présence d'autres protéines rapporteuses telles que le système x-gal / lacZ , ou la protéine de fluorescence verte, qui permettent une sélection basée sur la couleur et la fluorescence, respectivement.